[gramicidin]

グラミシジン。

ポリペプチド（15 amino acids）。
土壌細菌のバシラス属が生産する毒で、抗生物質の一。
バリノマイシン・ノナクチン同様、穿孔パッチ法に用いられる（Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration）。
rodでは12.5pg/l。

摂取すると、細胞膜の変質でイオン透過性が高まり、呼吸困難や心臓発作などを起こす。
また、グラミシジンは細胞内のタンパク質の製造を停止させ、生命維持が困難になり、最悪の場合死に至る。
致死量は体重1kgあたり15-17mg。

【構造】

　◆グラミシジンD（直鎖）(Hladky&Haydon)
　　　・グラミシジンA（80%）
　　　・グラミシジンB（6%）
　　　・グラミシジンC（14%）
　◆グラミシジンS（環状）

すべてバクテリア（Bacillus brevis）から作られる。

formyl-L-X-G-L-A-D-Leu-L-A-D-V-L-V-D-V-L-Trp-D-Leu-L-Y-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-ethanolamine

　　X=Vかisoleucine,
　　YはGramicidin AならTryptophan、BならPhenylalanine、CならTyrosine

細胞膜内部の疎水部位に結合し、短いβヘリックスを形成する。
βヘリックス同士はミセル内で頭がくっついてダイマーとなる。

【機能】

　◆ポア形成機序
　　　遅い
　　　gramicidin分子のhead-to-head dimer形成がチャネル形成に必要なため
　　　　　(Hladky and Haydon, 1984)
　　　nystatinやamphotericin Bでは単一分子でチャネル形成可能
　◆局所抗生物質（表皮に局所投与）
　　　ポア(4Å)形成してバクテリア膜透過性を高めイオン濃度勾配破壊
　　　・ポア(チャネル)内部に強弱2つのcation-binding sites存在
　　　　　・1価カチオンの選択的透過(Andersen,1984; Sawyer,Andersen,1990)
　　　　　　　　透過性 H+>NH4+ >> Cs+>Rb+>K+(Na+の2.9倍)>Na+>Li+
　　　　　　　　透過率はaqueous移動度と同程度
　　　　　・2価カチオン（Ca2+など）によって阻害（孔閉塞）
　　　　　・アニオンを通さない（特にCl-: Tajima,Akaike,1996）
　　　　　　　　多くのカチオンよりhydration shellが熱力学的に強いため
　　　・チャネルには6水分子が入る
　　　　　イオン透過時にはイオンは前後の水と結合(flux coupling)
　　　・ポア形成に40min(20-25ug/ml:Neuromethods35 Walz,Baker)
　　　　　　100ug/mlなら20min以内であく
　　　　　　stock濃度エタノール 10mg/ml,DMSO 1-5mg/ml
　　　　　　stock調整の際には数秒sonication
　　　　　　stockは1実験・pip solは2hrsもつ（冷やすと長持ち）
　　　　　　50mg/mlから0.1mg/ml（Ichiyanagi,Endoh,2002）
　　　　　　　（Tajima,Akaike,1996）
　　　　　　　（Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride）
　　　　　・溶液はすぐ力価減少（2時間程度で作り換え推奨）
　　　　　・15-20minでRs=20MO（Akaike）
　　　　　・状態良ければ4hrsは安定記録可能（Akaike）
　　　　　・5ug/mlでは自発rupturing少ない（Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration）
　　　　　　　20-50ug/mlではポア形成速いが自発rupture頻発
　　　　　　　状態よければ2.5-6MOの電極でRs=25-50MOで1時間以上安定記録
　◆表皮内には投与不可能
　　　・低濃度でも溶血 hemolysis をもたらす

【技術】

　◆穿孔パッチ法
　　　・溶解性
　　　　　・メタノール（10mg/mlストックから0.1mg/mlに希釈）
　　　　　・DMSO
　　　　　15sec sonication行いフィルター使用せず（Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration）
　　　・シール困難時はpipette先端にgramicidin含まない溶液
　　　・ホールセルとの区別
　　　　　・蛍光色素
　　　　　・高[Cl-]にして応答から判断

【利用例】

　・外側上丘オリーブ神経で[Cl-]i発達とともに減少（Kakazu,Nabekura,1999）
　・傷ついた神経では[Cl-]i高まり興奮性に変化（van den Pol,Chen,1996）
　・フロセミドも用いて共役トランスポーターの動態計測（Kakazu,Nabekura,2000）