キンカチョウが歌っているときのHVCの活動を、頭部固定下の二光子顕微鏡撮影(主にGCaMP6s; 30Hz)、もしくは微小電極法で記録したところ、Ca応答にはGTE(Amador et al.,2013)との相関は見られず、抽象的なタイミング情報を担うというuniform distribution model(Long and Fee, 2008)を支持する結果となった。
類似の結果が同時掲載された(Lynch,Fee,2016)。

【結果】

　◆頭部固定
　　・ただ固定すると歌わない(6 birds)
　　・定期的にメスを見せると固定しても歌う(72/78 birds)
　　・歌の質やタイミングは変わらない
　　　　grobal similarityも同様(%similarity * accuracy * seq match)
　◆Ca signal
　　・AAV9.Syn.GCaMP6s.WPRE.SV40 (Penn Vector Core)(ほとんどの鳥)
　　　　30-100nl * 3-6 sites
　　　　AAV9.CamKII0.4.Cre.SV40, AAV9.CAG.Flex.GCaMP6f.WPRE.SV40
　　　　AAV9.CamKII0.4.Cre.SV40, AAV9.CAG.Flex.GCaMP6s.WPRE.SV40
　　・onsetは、juxtacellular記録のburstの1st spikeから5.9±3.7ms
　　　　>=3spikes(>100Hz)で、他のburstの>1s後かつ>1.5s前が解析対象
　　・複数試行のデータを歌のonsetに合わせて結合
　　　　onsetはベイズ推定deconvolution(Pnevmatikakis,Paninski,2013)
　　　　　4つの並列MCMC(4000 sweeps; burn-in: 1500sweeps)
　　　　　　onsetは、MCMCごとの結果の中央値を平均した値
　　　　　試行間結合でonset推定精度増大
　　　　神経ごとにonset推定精度は大きく異なる
　　・数回のみburstする細胞をHVC-RA/HVC-Xとして解析
　◆一様分布モデルと合致(continuous sequential representation)
　　・294 burst events (250 cells; 5 birds; 45 syllables in total)
　　　　歌motifは同じ長さに線形time-warpingで揃えた
　　・burstはシラブル選択的ではない(syllable: 74/s; gap: 76.7/s)
　　　　onset, offset(最初のGTEと最後のGTE)にもlockしていない
　　・burstはGTEと関係ない
　　　　GTEは試行ごとに推定してgaussianフィルタ(SD=2.6ms)
　　　　　複数試行の結合GTEと相関高い順に並べて見て、手動で補正
　　　　　　missedピークの中央値を加えたり、歌に特徴ないものを除去
　　　　　GTE頻度はFeeのBoariによる方法と類似(Lynch,Fee,2016)
　　　　タイミングはGTEと相関ない
　　　　　GTE付近に分布させたシミュレーション（ポジコン）では相関あり
　　　　　　N burstsをGTE + SD + burst jitterに配置
　　　　尤度比検定でもuniform distribution modelが支持
　　　　　-30〜30msのoffsetをおいて検定しても同様の結果
　　　　　onset精度の高い(<10ms)186/294 eventsで検定しても同様
　　　　　gapのburstを除去して検定しても同様
　　・intracellular記録でも同様(28 bursts,21 cells, 3 birds)
　　　　burst(>=2 spikes, >200Hz) onset(1st spike)とGTEの相関なし
　　　　　onset uncertainty=3ms(Kozhevnikov and Fee, 2007)
　　　　閾値下EPSP onsetも相関なし(187 events, 26 cells, 3 birds)
　　　　　onset= EPSP peak(baselineの>2mVの最大値)の<8ms前の最小値
　　　　　　おかしい計算結果は手動で補正
　　　　　syllable選択性ない(syllable: 165events; gap: 164events)
　　　　　GTEとの相関なし
　　　　　　gap除いても結果同様
　　　　　　HVC-RAとHVC-Xを分けて解析しても同様
　　　　　　歌タイミングに合わせた平均PSPで解析しても同様
　　・多少の分散はサンプリングバイアスかも

【関連】

　◆過去のHVC Ca imaging
　　2-photon麻酔下(Graber,Hahnloser,2013; Peh,Mooney,2015)
　　head-mounted CMOS camera (Markowitz,Gardner,2015)
　◆歌にはsyllableとgap
　　　gapにおけるmini-breaths(Hartley and Suthers, 1989)
　　　　HVC活動と関係?(Andalman,Fee,2011)
　◆音響特性の変化と筋活動の相関
　　　(Goller and Cooper, 2004; Riede and Goller,2010;
　　　 Suthers et al., 1994; Vicario, 1991a)