単離したキンギョの網膜双極細胞にDM nitrophenいれて、UV flashで急速に[Ca]i高めた際の膜容量の増大を調べることで、放出量とkineticsの[Ca]i依存性を検討し、瞬間放出率が高く、Ca親和性が低いことが、放出機構の速さに寄与していることを明らかにした。

ほかに
Mennerick and Matthews 1996;
　　　　　Dynamics of synaptic vesicle fusion and membrane retrieval in synaptic terminals
　　　　　Inhibition of endocytosis by elevated internal calcium in a synaptic terminal

【方法】

　◆標本goldfish bipolar cell単離
　　　22-26度で単離から1-2h以内
　　○細胞外液（pH7.3）
　　　　115 NaCl, 2.6 KCl, 1.6 MgCl2, 1 CaCl2,
　　　　10 glucose, 10 HEPES
　　○細胞内液（pH 7.27）
　　　　62 Cs-gluconate, 31.2 Cs-HEPES, 6.24 TEA-Cl
　　　　10 DM-Nitrophen, 10 CaCl2, 5 DPTA, 1 Furaptra(Magfula-2)
　◆DM-Nitrophen
　　　・purity確認（Zucker,1993）
　　　・Ca入れてないとUV flashで放出起きない
　　　・UV flashの時間経過は放出に0.6ms程度まで影響
　◆Furaptra
　　（計測: Heinemann,Zucker,2004; Grynkiewicz,Tsien,1985）
　　　・エンドサイトーシス抑制するため[Ca]iを2倍にした
　　　　　（von Gersdorff&Matthews,1994）
　　　　　（普段の[Ca]i : Heidelberger&Matthews,1992）

【結果】

　◆放出のCa依存性
　　・flashで[Ca]iが40uMまで上昇
　　　　1.5ms後にCmが77fFくらいτ=5.2msで増大（放出率=191/sec）
　　　　Ca依存性電流はときどき非同期的に生じた
　　・暗いflashで[Ca]iが18.5uMまで上昇
　　　　放出は生じない（最低でも10uMは必要、普通20uM必要）
　　　　　（vonGersdorff&Matthews,1994と一致）
　　・その他
　　　　・[Ca]i = 24 uMならτ=77/sec
　　　　・[Ca]i = 107uMならτ=213/sec
　　　　・[Ca]i = 278uMならτ=1712/sec
　　・最大瞬間放出率100-150pF/sec
　　　　小胞直径50nmなら12M小胞/sec
　　　　1000小胞(17小胞/放出部位)が0.35msで放出する速度
　◆simulation
　　・放出量の[Ca]i依存性
　　　（Heinemann,Zucker,1994; Heinemann,Neher,1993）
　　　　大きい傾きと急速な飽和
　　　　　4つの段階的Ca bindingで放出モデルでよくfit可能
　　　　　　（3つでは端っこしかfitできない）
　　　　　　（独立Ca bindingで放出モデルではfitには6つ以上必要）
　　　　　　4つのCa結合速度14/mM/ms
　　　　　　Ca解離速度は1Caなら2/ms
　　　　　　　2Caなら2/msの0.4倍、3Caなら0.16倍、4Caなら0.064倍
　　　　　　　　（cooperativityを考慮したため）
　　　　　　　　（したがって解離定数はKd=143-9.14uMまで変化）
　　　　　　このモデルでは最大放出速度の半分は[Ca]i=194uM
　　・放出遅延の[Ca]i依存性
　　　　上のモデルを用いるとfit可能
　　　　　　Ca解離速度が0.128-2/msという仮定は正しいだろう
　　　　　　一定のON,OFF rateでrate constant速めると遅延速まってしまう
　　　　ここにはCa uncagingの遅さは影響していない
　　　　　　　uncaging速度の遅れではせいぜい0.6msしか説明できない