キンギョMb細胞とカエルsaccular有毛細胞のシナプス・リボンで、細胞内に高濃度EGTA(10mM)と速いカルシウム指示薬（Fluo-3 or Fluo-5F）導入して、全反射蛍光顕微鏡で、脱分極時のカルシウム流入部位(hot spot)を計測したところ、Ca流入部位はribbonsやdense bodiesの数とほとんど一致し、シナプス・リボン近傍にカルシウム・チャネルが存在することを示し、また、特にMb細胞では、放出部位がシナプス・リボン・Ca流入部位以外にも存在することを示した。

【結果】

　◆脱分極
　　・Caチャネル開くと蛍光強度突然増大
　　・閉じるとすぐに消失
　◆蛍光分子
　　・ribeye（B-domain of the synaptic ribbon protein）への抗体
　　　　　Synaptic ribbons・dense bodiesの標識
　　・Ca蛍光脱分極後も残存
　◆Mb細胞
　　・Ca流入部位少ない
　　　　　ribeye標識数と一致
　　　　　放出部位と類似
　　　　　　　active zones外にCaチャネルがないとはいえない(Fig. 1E,F)
　　・リボン密度は0.1/um2と推定
　　・リボン見難い
　　　（小さいためか: Evidence that vesicles on the synaptic ribbon of retinal bipolar neurons can be rapidly released; 有毛細胞: Lenzi,1999）
　　・放出部位
　　　　　・ほとんどはactive zone
　　　　　　　　active zoneとは2以上の小胞が300nm以内で放出される場所
　　　　　　　　0.10±0.03/um2(Zenisek,2000)
　　　　　　　　　　Ca流入数(0.11±0.02/µm2)と類似
　　　　　　　　　　ribeye免染数(0.10±0.01/µm2)と類似
　　　　　・1/3がリボン外で放出（solitary fusion events(outliers)）
　　　　　　　（500-1000ms脱分極(0mV): Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones）
　　　　　　　（有毛細胞と一致(Beutner,2001; Lenzi,2002）
　　　　　　　　
　　　　　　　　直径0.5umの円で推定したリボン数0.24±0.04/µm2
　　　　　　　　　　リボンの長軸は最長で0.5µm(von Gersdorff,1996)
　　　　　　　　　　ribeye免染数(0.10±0.01/µm2)の2倍
　　　　　　　　　　Ca流入数(0.11±0.02/µm2)の2倍
　　　　　　　　　　　　reluctant ribbonsで生じてるとは思えない
　　　　　　　　　　active zone放出数は外の175±32倍/um2（N=7）
　　　　　　　　　　　　outlierは重要ではないのでは

【関連】

　◆電気生理でdomains of high [Ca2+]証明
　　　・電子顕微鏡とともに有毛細胞(Colocalization of ion channels involved in frequency selectivity and synaptic transmission at presynaptic active zones of hair cells)
　　　・Xenopus培養運動神経(Yazejian,1997)
　　　・単離Mb細胞(Sakaba,1997)
　◆局所Ca流入計測
　　　・イカ巨大シナプスへCa依存蛍光タンパク質(Llinas,1992)
　　　・有毛細胞をカルシウム指示薬で共焦点蛍光顕微鏡
　　　・Xenopus運動神経をconfocal spot microscopyで(DiGregorio,1999)
　◆シナプス・リボン密度
　　　・frog saccular有毛細胞
　　　　　・Ca流入部位の80%以上がdense bodies部位(Issa&Hudspeth,1994; 1996)
　◆most rapidly releasable vesiclesの数（数msで放出）
　　　・脱分極では1100小胞/terminal（30fFジャンプ）
　　　　　リボン下小胞と細胞膜にdockされた小胞の和と一致
　　　　　（カルシウム・チャネルが密集するactive zoneの小胞のみ）
　　　　　　　(Ultrafast exocytosis elicited by calcium current in synaptic terminals of retinal bipolar neurons)
　　　・flash photolysis of caged Ca2+
　　　　　脱分極による放出の2.5-5倍多い(Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic terminal; Adenosine triphosphate and the late steps in calcium-dependent exocytosis at a ribbon synapse)
　　　　　（active zoneの小胞に加え、outlier小胞も放出）
　◆outlier機能してるのか？
　　　・Caチャネル少なくて放出可能？
　　　　　・[Ca2+]i 10µM以下では放出起きない（Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic terminal）
　　　　　・低[Ca2+]iでも放出(Continuous vesicle cycling in the synaptic terminal of retinal bipolar cells; Continuous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse)
　　　・受容体存在？
　　　　　・IPLのグルタミン酸受容体はリボン外にも存在（哺乳類: Synaptic distribution of ionotropic glutamate receptors in the inner plexiform layer of the primate retina)
　　　　　　　・active zoneからのspilloverかも
　　　　　　　　　(Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer; Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells; Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina)