二光子蛍光顕微鏡を用い、マウス視覚野スライスの1400の神経の自発発火を記録し、少数の神経群の間に同期したUP状態（cortical flashes）が空間的塊として観察できることを確認した。

マウス網膜の固定したvertical tissue sections (slices)でlucifer yellowやneurobiotinを導入した網膜双極細胞の形態を観察し、calretininを染めて3つの水平帯を可視化した状態で、IPL5層への投射様式から、9種類のcone bipolar cellと1種類のrod bipolar cell typeに分類し、さらに、ON BCマーカーであるG-protein Ggamma13でOFF BCとの区別を行った。
少なくとも2種類のOFF-cone bipolar cells (Types 1 and 2)はneurokinin 3 receptors (NK3R)の免疫染色で染まり、さらにOFFとON-cone bipolar cell (Types 3 and 5)1種類ずつがcalcium-binding protein CaB5の抗体で染まった。
先行研究のラットと霊長類の研究と比較した。

bipolar cell terminalのcell-attached patchesを脱分極させた際、EGTAによって抑制されるCa依存性放出が生じ、その放出率は、同じくCaによって活性化されるKCa電流と相関があり、KCa電流の見られない41%のtermianlでは放出は生じなかった
これと同時にKCaの活性化が生じ、また、エクソサイトーシス・エンドサイトーシス部位はカルシウム・チャネルやKCa channnelsのクラスターと局在していることが分かった。
電子顕微鏡による観察では、シナプス・リボン直下のactive zoneの膜にdockされているのは16小胞以下であったが、リボン外の膜にも1.5/µm2の密度で結合しており、リボン密度が0.10±0.02/µm2であったことから、43%のKCa電流が見えなかったpatchesではactive zoneが存在しなかったと考えられ、一方、Ca channelのクラスターはリボン密度と類似しており、カルシウム・チャネルはリボン直下に存在していることをしめした。
ただしリボン外にカルシウム・チャネルが存在する可能性は否定できず、また、リボン外に小胞が繋留されていることから、Ca2+の拡散でこれらが放出される可能性もある。

新手法であるSHG法で、巨大な1層小胞群を用いて、screening protocolによって膜電位を計測

【原理】

　◆molecular hyperpolarizability変更
　◆molecular alignment度合いの変化

単一小胞の放出ではBGのAMPA受容体そんなに活性化できない。

【】

　◆calyx
　　　・EPSC逆畳み込みでRRPは2400（Sakaba and Neher,2001)
　　　・膜容量測定でRRPは3300-5200（Sun and Wu,2001)
　　　　　どちらも正確なら、放出された小胞の一部しか検出されない
　◆BC
　　　・単離軸索終末で64%放出がクラスター(Zenisek,2000)
　　　　　　カルシウムスポット数とリボンの数と相関(Zenisek,2003)
　◆hair cell
　　　・AZから数百nm離れたoutlying docked vesicles
　　　　　(Beutner,2001; Lenzi,2002)
　◆グリア細胞・海馬oligodendrocyte precursor cells (Bergles,2000)
　　　電子顕微鏡でvesicle-filled presynaptic boutons
　　　pre- and postsynaptic specializations
　　　・詳細に小脳neuron-glia relationship調べた
　　　　　(Palay and Chan-Palay 1974; Spacek 1985)
　　　　　(Xu-Friedman et al. 2001)
　　　　　(Grosche et al. 2002)
　　　　　　CF varicositiesは小胞あるがほとんどがAZ外
　　　　　　CF and PF elements and BGsは十分調べられてないのでは
　　　　　　電子顕微鏡では観察できないのでは
　◆BG sideのquantal応答のキネティクス速い
　　　200–300us to rise, 1–2 ms to decay
　　　quantal amplitudes are sizable (10–20 pA)
　　　　nearly synchronous opening of a number of AMPA receptors
　　　　AMPA受容体はクラスターかも
　　　　　　でもZenisek(2000)から判断すると放出部位に再現性なさそう
　　　　　　　　AMPA受容体は高密度で広く分布してるのかも

　◆spill over
　　　・グルタミン酸は高濃度でも時空間的に急速に減衰
　　　　　(Barbour 2001) and (Franks et al. 2003)
　　　　　数百nm以上は届かない
　　　　　　放出部位がたくさんだとspillover可能
　　　　　　　(DiGregorio,2002) and (Xu-Friedman and Regehr 2003)
　　　　　ectopic放出のほうが効果的だろう（松井）
　　　　　　multivesicular放出
　　　　　　　(Wadiche and Jahr 2001(Foster et al. 2002)
　　　　　　　これでもspillover可能かも
　　　　　　　　　CF-BG AMPA receptorのわずかしか刺激できない
　　　　　　　　　CTZで親和性高めるとspillover貢献度上昇
　　　　　　　　　　　シナプス部位からspilloverは確かにある
　　　　　　　　　　　高親和性のmGluRsが機能してるかも

　◆EGTA-AMの効果
　　　PF presynaptic terminalでのAP後のCa減衰促進
　　　　PCs and interneuronsの非同期放出抑制(Atluri&Regehr,1996)
　　　　本研究との違いの原因は本標本が以下のものだからだろう
　　　　　Ca電流はAZにしか存在せず拡散
　　　　　Caチャネル密度が小さい(Meinrenken,2002)
　　　　　Ca感受性が小さい
　◆ectopic放出
　　　　spilloverに比べて速い電流と高い濃度
　　　　BGのAMPA活性は重要
　　　　　　GluR2 subunitないCa2+-permeable AMPAがBGには発現
　　　　　　　　 (Burnashev et al., 1992)
　　　　　　　ウイルス感染でGluR2導入するとCa透過性減少
　　　　　　　　シナプス囲むBG突起が縮小（Iino et al. (2001)
　　　　　　　　　　シナプス部位感知してグルタミン酸回収の役割
　　　　　　　　　　BGは発達中で活性化始めたシナプスを感知してるのかも

OPLではなくIPLのNaチャネルが網膜神経節細胞の周辺抑制に必要なことがわかってきたため（___; Spike intitiation and propagation in wide field transient amacrine cells of the salamander retina; Action potentials are required for the lateral transmission of glycinergic transient inhibition in the amphibian retina）、サラマンダー網膜スライスの網膜双極細胞から記録を取ったところ、TTXによって光依存性GABA抑制入力が減少し、その際、視細胞から網膜双極細胞への出力(光によるEPSC)は影響は受けなかったが、OPLの影響を排除するため、網膜双極細胞を細胞外電気刺激したり、カイニン酸puffでアマクリン細胞を刺激した結果、やはりTTXは側方向(300um)からのIPSCsを阻害することがわかったが、近傍(60um)に生じさせたIPSCはTTXによって阻害されなかった。

【問題意識】

　◆IPLでのGABA放出のNaスパイクへの依存
　　　wide- and narrow-field ACで違うかも
　　　単一ACの中でもlong-rangeとlocal signalingで違うかも

【方法】

　◆標本
　　　スライス(150-350um)
　　　dim white light（光応答ちゃんととりたいときはinfrated照明）
　◆細胞内液
　　　95.25 Cs-gluconate, 8 TEA, 0.4 MgCl2, 1 EGTA, 10 HEPES（pH 7.5 HCl）
　　　光応答とるとき
　　　　　ATP,GTP,cGMP加えたりした（Nawy&Jahr,1991）
　　　　　gramicidin穿孔パッチ75ug/ml in methanol（N=4）
　◆細胞外液
　　　112 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 5 glucose, and 5 HEPES
　　　(pH 7.8 with NaOH)
　　　strychnine (2–5uM) (Belgum,1984)をGABA IPSCのみみるためいれた
　　　D-AP5(40uM)で自発IPSC減少させた
　◆GABAブロック
　　　bicuculline(100–200uM)とpicrotoxin(100–200uM)
　　　GABACブロック 3-APMPA(500uM), I4AA(15uM)
　◆光刺激
　　　tungsten-halogen lamp (20 W)の白色光(800um) 2.9×10^7 quanta/um2/s
　　　もしくは500nmの3×10^5 quanta/um2/s

【結果】

　◆BC
　　○光によるGABA IPSCはTTXで減少（Naチャネル依存のlateralある）
　　　　　holding -10 to 0mVでIPSC計測
　　　　・D-AP5なしではTTX効果やや減少（Dixon&Copenhagen,1992）
　　　　・bicucullineありでもIPSCありTTX効果もあり
　　　　　　　AC-ACのGABAA出力無視してもTTX効果があった
　　　　　　　　　直接BCに出力するACにNaチャネルがある
　　　　・TTX効果はOPLに働いたわけでは無い
　　　　　　　OPLのNaチャネル
　　　　　　　　　網膜水平細胞(Shingai&Christensen 1983; Ueda,1992)
　　　　　　　　　ヒト杆体視細胞(Kawai,2001)
　　　　　　　ephaptic feedback mechanism (Kamermans,2001)
　　　　　　　STR, BIC, PTX, D-AP5での光EPSC(-60to-70mV) TTXで変化なし
　　　　　　　　　さらにI4AAいれても変わらない
　　　　・BCのNaチャネルも関係ない
　　　　　　　cone BCに発現（rat: Pan&Hu,2000; goldfish: Zenisek,2001）
　　　　　　　cobalt(4mM)でパルス(80 to 35/0 mV)与えてもINaなし(N=16)
　　　　　　　　　　TTXの電位依存性電流への影響もなし
　　○TTXでGCへの自発EPSCは減少してない（BCにはNaチャネルない）
　　　　・GCのAMPA/KA性sEPSCs（STR, BIC, PTX, D-AP5）
　　　　　　frequency変化せず
　　　　　　　（control: 22.4±4.7 events/s; TTX: 25.1±5.4 events/s）
　　　　　　amplitude変化せず
　　　　　　　（control: 9.6±1.5 pA; TTX: 9.7±1.4pA）
　　　　　　（Tian(1998)やGC光EPSC変わらないとしたCook(1998)と一致)
　　　　・GCへのGABAA性IPSCは減少
　　　　　　(Bieda&Copenhagen 1999; Flores-Herr,2001)
　　○TTXでGCのGABAA性IPSCは減少（TTXはACに効果）
　　　（STR, D-AP5(大きい自発IPSCをブロック), holding 0mV）
　　　　・頻度減少（control: 3.7±1.3 events/s; TTX: 0.98±0.5 events/s）
　　　　・強度減少（control: 9.7±2.8pA; TTX: 5.4±0.3 pA）
　　　　・BCへのGABAC性IPSCはS/N比悪く見えなかった
　◆BC電気刺激（1-10uA, 1ms）でBCにGABA性IPSC
　　（STR; holding 0mV）
　　　・local（記録BC細胞体の横60um以内）
　　　　　　TTX依存性が小さい
　　　　　　BICいれてもIPSCありTTX依存性小さい
　　　・lateral（記録BC細胞体の横300um以上）
　　　　　　TTX依存性が高い
　　　　　　BICいれてもIPSCありTTX依存性大きい
　◆ACのkainate focal puff（1mM; 5-6lb./in2, 10-15ms）でBCにGABA性IPSC
　　（STR; holding 0mV）
　　　・local（記録BC細胞体の横60um以内）
　　　　　　TTX依存性が小さい
　　　　　　BICいれてもIPSCありTTX依存性小さい
　　　　　　GCへのGABAA性IPSCはTTXで抑制されたが効果はlateralより小さい
　　　・lateral（記録BC細胞体の横300um以上）
　　　　　　TTX依存性が高い
　　　　　　BICいれてもIPSCありTTX依存性大きい
　　　　　　GCへのGABAA性IPSCはTTXで大きく抑制
　　　・puffに対するACでのEPSCはTTXで変化なし（N=7）

【文献】

　◆網膜水平細胞
　　　・網膜双極細胞の周辺抑制に必要(Kaneko 1970; Werblin&Dowling,1969)
　　　・網膜神経節細胞の周辺抑制にも必要（Organization of the retina of mudpuppy, Necuturus maculosis. II. Intracellular recording)
　　　　　HC過分極でGC周辺効果(Dogfish ganglion cell discharge resulting from extrinsic polarization of the horizontal cells; Analysis of the horizontal cell contributions to the receptive field surround of ganglion cells in the rabbit retina）
　◆IPLの機能
　　　・網膜神経節細胞の周辺抑制に必要
　　　　　(Effects of picrotoxin and strychnine on rabbit retinal ganglion cells: lateral interactions for cells with more complex receptive field; Neural interactions mediating the detection of motion in the retina of the tiger salamander)
　　　　　(Surround inhibition of mammalian AII amacrine cells is generated in the proximal retina; ___;
　　　　　 Action potentials are required for the lateral transmission of glycinergic transient inhibition in the amphibian retina; TTX attenuates surround inhibition in rabbit retinal ganglion cells)
　　　　　・GCにはGABAA受容体
　　　　　　　(Sodium action potentials are not required for light-evoked release of GABA or glycine from retinal amacrine cells; Cook&McReynolds,1998a;
　　　　　　　 Synaptic currents generating the inhibitory surround of ganglion cells in the mammalian retina)
　　　　　　　ferret AC脱分極でBCにIPSC(Lukasiewicz&Shields,1998)
　　　　　・BCにはGABAC受容体
　　　　　　　(Synaptic currents generating the inhibitory surround of ganglion cells in the mammalian retina; GABA transporters regulate inhibition in the retina by limiting GABAC receptor activation;
　　　　　　　 Different combinations of GABAA and GABAC receptors confer distinct temporal properties to retinal synaptic responses)
　　　　　　　(Temporal contrast enhancement via GABAC feedback at bipolar terminals in the tiger salamander retina)
　　　・ACによるACのserial inhibition
　　　　　GABAA受容体依存(Roska,1998|Response to change is facilitated by a three-neuron disinhibitory pathway in the tiger salamander retina; Serial inhibitory synapses in
retina)